Un nuevo método que aumenta la resolución en los análisis de conjuntos de proteínas

Científicos brasileños asocian la espectrometría de masas, la cromatografía líquida bidimensional y la movilidad iónica para estudiar la proteómica de las células cerebrales probablemente implicadas

04.01.2018

Uno de los principales desafíos en el área de la proteómica consiste en lograr discriminar entre moléculas que, pese a que son estructuralmente distintas, tienen la misma masa. Sucede que el principal aparato que se emplea en este tipo de estudios - el espectrómetro de masas - funciona como una balanza molecular, es decir, separa las moléculas analizadas según su masa.

Una de las formas de disminuir las confusiones en el interior del aparato consiste en procesar previamente la muestra con técnicas tales como la cromatografía líquida, capaz de separar entre las proteínas que poseen afinidad con el agua (hidrofílicas) y aquéllas que carecen de dicha afinidad (hidrofóbicas). Las moléculas hidrofílicas entran en primer lugar en el espectrómetro y las más hidrofóbicas se ubican a lo último, lo cual disminuye la posibilidad de que el aparato lea dos moléculas distintas de masa equivalente como si fueran una sola cosa.

"Es como montar un rompecabezas con millones de piezas. Cuando uno abre el saco de piezas por primera vez, éstas aparecen mezcladas y superpuestas. El primer paso consiste en separarlas. Los que trabajamos en proteómica estamos siempre intentando perfeccionar las técnicas a los efectos de concretar esa separación", dijo Daniel Martins-de-Souza, coordinador del Laboratorio de Neuroproteómica de la Universidad de Campinas (Unicamp), en Brasil.

En el marco de un estudio cuyos resultados salieron publicados recientemente en la revista Proteomics, y destacados en su portada, el grupo de Martins-de-Souza optimizó un método tendiente a aumentar la resolución de los análisis proteómicos con espectrometría de masas. Merced a la unión de otras dos técnicas - la de cromatografía líquida bidimensional y la de movilidad iónica - el equipo de la Unicamp logró identificar 10.390 proteínas expresadas en oligodendrocitos, las células del sistema nervioso central encargadas de la producción de mielina, una sustancia lipídica fundamental para el intercambio de información entre neuronas.

En un trabajo anterior, en el cual se utilizó únicamente la cromatografía líquida unidimensional para efectuar la separación previa, el grupo había identificado en ese mesmo tipo de células tan sólo 2.290 proteínas.

"Ahora contamos con un banco de datos mucho más completo de las proteínas de los oligodendrocitos, y esto será útil tanto para nuestros estudios como para los de otros investigadores del área. Los datos se encuentran disponibles online y puede bajárselos. Asimismo, esta técnica de optimización puede aplicarse al estudio del proteoma de cualquier muestra biológica de interés", dijo Martins-de-Souza.

Con el apoyo de la Fundación de Apoyo a la Investigación Científica del Estado de São Paulo (FAPESP), el grupo de la Unicamp ha venido estudiando desde hace algunos años el proteoma de los oligodendrocitos con el objetivo de comprender mejor las causas de la esquizofrenia, a los efectos de proponer nuevos abordajes terapéuticos.

Según Martins-de-Souza, los tratamientos disponibles actualmente se enfocan en las neuronas. Con todo, a juicio del investigador, las fallas en la comunicación neuronal observadas en portadores de esquizofrenia pueden ser consecuencia de disfunciones en los oligodendrocitos.

"Una de nuestras líneas de investigación apunta a analizar de qué manera modifican el proteoma de los oligodendrocitos los medicamentos que se utilizan contra esta enfermedad. Con esta nueva metodología podremos obtener cinco veces más información referente al papel de esos fármacos", afirmó.

Este trabajo se desarrolló en el marco del posdoctorado de Juliana Silva Casoli y la maestría de Caroline Brandão Teles, ambas becarias de la FAPESP dirigidas por Martins-de-Souza.

Cómo funciona

El primer paso de los análisis proteómicos basados en la espectrometría de masas consiste en romper las proteínas extraídas de la muestra biológica de interés - en este caso los oligodendrocitos - en partículas menores llamadas péptidos.

"Una proteína pequeña puede dar origen al menos a 10 péptidos distintos. El espectrómetro tiene dificultades para operar con la molécula entera púes la misma es muy grande", explicó Martins-de-Souza.

Luego el grupo sometió la muestra a la separación mediante cromatografía. Pero en lugar de utilizar una sola matriz, como cuando se aplica la técnica convencional, se emplearon dos. De este modo, se produce una primera separación, en la cual tan sólo una quinta parte de los péptidos inyectados va hacia el espectrómetro en forma líquida. Después se produce una segunda etapa de separación, en la cual va el segundo quinto, y así sucesivamente.

"Es como si antes hubiésemos estado dispersando las piezas del rompecabezas sólo con una mano y ahora lo estuviéramos haciendo con ambas", dijo el investigador.

Dentro del espectrómetro, la muestra se transforma en gas y vuela de un lado al otro en vacío. Cuanto menor es el péptido, más rápido llega a destino, y así es como el aparato calcula la masa.

En ese momento, cuando las moléculas están volando dentro del espectrómetro, entra en acción la técnica de movilidad iónica, al inyectarse un chorro de gas dentro del aparato a través de un tubo.

"La resistencia que cada molécula le ofrece al gas depende de su forma tridimensional. Por ende, de haber dos péptidos distintos con igual masa que vuelan juntos y si lanzamos un viento en la dirección contraria, la tendencia indica que se producirá una separación debido a la fuerza de la resistencia al gas. Es como si tomáramos dos hojas de papel de igual masa e hiciéramos un bollo sólo con una de ellas. Debido a su forma, la que está hecha un bollo llegará más rápido al piso", explicó Martins-de-Souza.

Al final del experimento, quedaron reconstruidos los más de 223 mil péptidos identificados con el espectrómetro mediante el empleo de herramientas de bioinformática, lo que dio origen a las 10.390 proteínas descritas en el trabajo. El grupo también mapeó -valiéndose de la bioinformática- los compartimentos celulares donde se encuentran las proteínas y los procesos biológicos en los cuales las mismas participan.

"Lo ideal es identificar al menos dos péptidos por proteína. De ese modo, podemos tener la seguridad de que una molécula se encuentra presente en efecto en la muestra, ya que difícilmente hallamos dos proteínas con dos péptidos exactamente iguales. En este trabajo, alrededor del 20% de las proteínas fueron identificadas por más de 20 péptidos", comentó el investigador.

También según Martins-de-Souza, esta metodología permitió identificar incluso proteínas poco abundantes en la muestra, presentes en cantidades alrededor de 10 millones de veces menores que las moléculas más expresadas.

"Uno de los problemas de la espectrometría de masas consiste en que una pieza muy grande del rompecabezas puede esconder a las otras menores. Pero con una buena herramienta para esparcir las piezas se vuelve posible verlas prácticamente a todas", dijo.

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo

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