SiRNA

El nombre siRNA son las siglas en inglés de small interfering RNA, en español ARN pequeño de interferencia o ARN de silenciamiento.

El siRNA es un tipo de ARN interferente que interviene en el mecanismo denominado interferencia de ARN (RNA interference, RNAi), donde el siRNA interfiere con la expresión de un gen específico, reduciéndola. Además, los siRNAs también actúan en otras rutas relacionadas con el RNAi, como en la defensa antiviral o en la organización de la estructura de la cromatina en un genoma. La complejidad de estas rutas es el objeto de intensos estudios, y su descubrimiento fue la razón por la cual Craig C. Mello y Andrew Fire recibieron el Premio Nobel de Fisiología y Medicina 2006.

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Definición y modo de funcionamiento

Los siRNAs son moléculas de ARN doble hebra de 20-21 nucleótidos (nt) perfectamente complementarias, que se originan a partir de un ARN largo de doble hebra (dsRNA, double strand RNA). Los dsRNAs pueden ser de origen endógeno (por ejemplo los tránscritos generados a partir de secuencias de ADN repetidas en tándem), o de origen exógeno (como virus o transgenes). La enzima responsable del procesamiento del dsRNA en moléculas de siRNAs es Dicer, una enzima citoplásmica de la familia ARNasa III, que procesa el dsRNA en fragmentos de ARN doble hebra con extremos 5' fosfato y 2 nucleótidos libres con extremo hidroxilo (-OH) en 3'^[1] [1].

Los siRNAs suprimen la expresión de los genes diana mediante el corte del ARN mensajero (ARNm) complementario en dos mitades, a través de la interacción de la hebra antisense del siRNA con el complejo RISC (RNA-induced silencing complex). Las dos mitades del ARNm son posteriormente degradadas por la maquinaria celular, lo que convella la supresión de la expresión del gen^[2] [2].

Por otro lado, los siRNAs promueven la modificación del ADN, facilitando el silenciamiento de la cromatina, ya que favorecen la expansión de los segmentos de heterocromatina, a través del complejo RITS (RNA-induced transcriptional silencing)^[3] [3].

Descubrimiento

PTGS en plantas

El mecanismo de interferencia de ARN (RNAi) se observó por primera vez en plantas como parte del silenciamiento post-transcripcional de genes (PTGS). Investigadores que trataban de introducir trasgenes en petunias para conseguir flores de un color violeta más intenso, obtuvieron flores con zonas blancas, lo que indicaba que tanto los transgenes introducidos como los genes endógenos habían sido silenciados^[4] [4]. Este efecto se denominó co-supresión, y se observó que podía inducirse por:

• la expresión de un transgén en altos niveles
• transgenes que se expresan en niveles menores pero que se integran en el genoma de la planta en copias múltiples
• por secuencias homólogas a un gen endógeno que se han introducido en un virus

Por esta razón, se supuso que éste era un mecanismo de defensa en las plantas, de forma que éstas responden a la infección de los retrovirus mediante la destrucción de los ARN virales. Sin embargo, el mecanismo de acción era desconocido.

La tecnología anti-sense en gusanos

Por otro lado, los investigadores que trabajaban en la década de los 90 en el gusano Caenorrhabditis elegans, inyectaban ARN-antisense en las gónadas del gusano para tratar de interferir con la expresión de los genes, ya que pensaban que el ARN-antisense se aparearía con el ARNm (sense), evitando de esta forma la traducción del ARNm y suprimiendo la expresión del gen objetivo. Sin embargo, Guo y Kemphues^[5] [5]), observaron que la inyección de ARN-sense en el gusano era igualmente eficaz que el ARN-antisense para la supresión de la expresión génica. Pero no podían explicar por qué razón.

En 1998, Andrew Fire, Craig C. Mello y colaboradores publicaron un trabajo en Nature^[6] [6], en el cual indicaban que, si inyectaban sólo ARN de hebra simple en el gusano, tanto sense como antisense, no se observaba ningún efecto. Sin embargo, si inyectaban ARN doble hebra (dsRNA), observaban la supresión específica del gen objetivo. Esto puede parecer contradictorio con los resultados de Guo y Kemphues, pero éstos inyectaron ARN de hebra simple (sense o antisense) que no había sido purificado, de forma que en el proceso de producción se producen segmentos de doble hebra, que son los que generan la supresión observada por Guo y Kemphues. Sin embargo, Fire y Mello utilizaron ARN purificado, que no contiene dsRNA y por tanto es inactivo. Cuando las hebras sense y antisense se aparean para producir dsRNA, el efecto de supresión es 100 veces mayor al observado con las hebras simples por separado.

Asimismo, en el mismo reporte, Fire y Mello establecieron que la interferencia de la expresión del gen objetivo se produce a nivel del ARNm: cuando inyectaron en gusanos dsRNA contra el gen mex-3, detectaron que el ARNm de mex-3 desaparece, y por tanto los gusanos no son viables. Sin embargo, cuando inyectaban ARN de hebra simple (sense o antisense) contra mex-3, la mayor parte del ARNm de mex-3 permanecía intacto, y por ello no se observa fenotipo.

Igualmente, también establecieron que el efecto de supresión sólo ocurre si el dsRNA que se introduce en el gusano es complementaria de una región codificante (exones), pero no si es complementaria de una región no codificante (intrones o el promotor). Esto indica que la interferencia se produce a nivel del ARNm, cuando ya se han eliminado los intrones del pre-ARNm, y por tanto es un mecanismo post-transcripcional.

Identificación de los componentes del mecanismo de RNAi

Estudios posteriores en plantas y gusanos permitieron establecer que, en presencia de dsRNA, se generan moléculas de siRNA de 20-25 nucleótidos mediante la acción de Dicer y que la hebra antisense de los siRNAs se asocian al complejo RISC, donde funciona como guía para identificar el ARNm complementario, promoviendo su corte y posterior destrucción, provocando la supresión de la expresión del gen.

Utilización en el laboratorio

Tiempo después, en 2001, Thomas Tuschl y sus colegas demostraron que siRNAs sintéticos eran capaces de inducir RNAi en células de mamífero y documentaron su trabajo en un reporte publicado en Nature^[7] [7]. Este descubrimiento suscitó un gran interés en la utilización de la técnica de RNAi para investigación biomédica y desarrollo de nuevos fármacos.

Aplicaciones

Actualmente son una herramienta muy utlizada por el investigador que desea bloquear la expresión de un gen por un tiempo limitado, a diferencia de lo que se obtiene realizando un knock-out. Suelen utilizarse precursores de RNAi, ya sea ARN doble cadena del gen target a reprimir, para que sean procesados por Dicer o directamente ARN monocatenario complementario al ARNm a silenciar. Cuando se trabaja con cultivos celulares, generalmente el vehículo utilizado son liposomas.

Referencias