Electroforesis en gel

  La electroforesis en gel es un grupo de técnicas empleadas por los científicos para separar moléculas basándose en propiedades como el tamaño, la forma o el punto isoeléctrico. La electroforesis en gel se utiliza generalmente con propósitos analíticos, pero puede ser una técnica preparativa para purificar moléculas parcialmente antes de aplicar una espectroscopía de masas, una PCR, una clonación o una secuenciación de ADN.

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Significado

La segunda parte del nombre, gel se refiere a la matriz usada para separar las moléculas. En muchos casos un gel es un polímero entrelazado de porosidad controlable. Cuando la separación es de proteínas, ADN o ácidos nucleicos pequeños (ADN, ARN o ribonucleótidos), el gel está compuesto por diferentes concentraciones de acrilamida/bis-acrilamida y un iniciador de la polimerización, para producir redes de poliacrilamida de diferentes tamaños. Para separar ácidos nucleicos grandes (más de unos centenares de bases), la matriz empleada es agarosa purificada. En ambos casos, el gel forma una matriz sólida pero porosa. La acrilamida, en contraste con la poliacrilamida, es una neurotoxina y debe ser manejada cuidadosamente para evitar envenenamientos.

La primera parte del nombre, electroforesis, se refiere a la fuerza electromotriz que es empleada para desplazar las moléculas a través del gel. Al situar las moléculas en el gel y aplicar una diferencia de potencial eléctrico, las moléculas se mueven a diferentes velocidades, hacia el cátodo, si están cargadas positivamente, y hacia el ánodo, si están cargadas negativamente (en una electroforesis, los electrodos se comportan igual que en una cubeta electrolítica).

Aplicaciones

Ácidos nucleicos

En los ácidos nucleicos la dirección de migración es del electrodo negativo al positivo, y esto es debido a la carga negativa presente en el esqueleto azúcar-fosfato. En los fragmentos de ADN dobles (con estructura de doble hélice) la velocidad de migración es inversamente proporcional a su tamaño. En fragmentos simples de ADN (una sola cadena) y ARN, dichas moléculas tienden a plegarse de forma compleja y a migrar de forma más complicada, según la estructura terciaria formada tras el plegamiento. Sin embargo, compuestos que puedan romper los enlaces de puente de hidrógeno, como el hidróxido de sodio o la formamida, son empleados para 'desplegar' las moléculas plegadas y permitir que la velocidad de migración dependa únicamente del tamaño y no de la estructura formada tras el plegamiento.

Proteínas

Por otra parte, las proteínas no tienen una estructura predecible como los ácidos nucleicos, y por tanto sus velocidades de migración no son similares entre ellas. Incluso puede que no migren ni al aplicar una fuerza electromotriz (al encontrarse en su punto isoeléctrico). En estos casos, las proteínas se desnaturalizan mediante la adición de un detergente como el dodecilsulfato sódico/dodecilfosfato sódico (SDS/SDP). Estos detergentes son agentes reductores que rompen los enlaces disulfuros, separando a la proteína en sus sub-unidades y además le otorgan una carga neta negativa que les permite migrar a través del gel en relación directa a su tamaño, ya que la cantidad de cargas negativas que se unen a la proteína depende del tamaño de ésta, existiendo una relación masa/carga similar. Además, la desnaturalización hace que pierdan su estructura terciaria y por tanto su velocidad de migración es proporcional al tamaño y no a su estructura terciaria.

Revelado y visualización

Cuando se ha completado la electroforesis, las moléculas más pequeñas han llegado al ánodo. Entonces se pueden 'revelar' mediante la adición de un colorante específico para hacerlas visibles. Se emplean compuestos como el bromuro de etidio, para los ácidos nucleicos, o la plata, para las proteínas. Asimismo se emplean otros métodos para visualizar la separación de la mezcla en el gel. Si el reactivo es fluorescente bajo la luz UV, se puede simplemente hacer una fotografía de la placa bajo dicha luz. También, si las moléculas contienen átomos radiactivos se puede efectuar una autorradiografía.

Si se han inyectado varias mezclas una junto a otra en la placa, se producirán separaciones paralelas. Cada separación mostrará distintas bandas correspondientes a cada componente de la mezcla. Si las separaciones son incompletas, se dará un solapamiento entre bandas haciendo indistinguibles dos o más componentes.

Las bandas en diferentes separaciones paralelas que están a la misma distancia del principio significa que contienen moléculas que han atravesado el gel a la misma velocidad. Existen marcadores especiales que contienen una mezcla de moléculas de tamaño conocido. Si se hace una electroforesis de un marcador con una mezcla desconocida, las bandas observadas en el marcador pueden ser comparadas con las obtenidas en la mezcla desconocida para determinar su tamaño. La distancia a la que se encuentra la banda del principio es (aproximadamente) inversamente proporcional al logaritmo del tamaño de la molécula.

Tipos

La electroforesis en gel se utiliza en biología molecular, genética y bioquímica:

• La electroforesis en gel de muestras grandes de ADN y ARN se efectúa en geles de agarosa.
• La electroforesis de proteínas se lleva a cabo en en geles de poliacrilamida-SDS (SDS-PAGE), por electroforesis en gel nativa o electroforesis 2-D.
• Electroforesis capilar.
• Electroforesis de ADN.
• Zimografía:

Zimografías en gel copolimerizado La zimografía es una técnica electroforética que permite observar actividad de proteasas. Se realiza con poliacrilamida y a diferencia de laselectroforesis de proteínas mas simples, la polimerización de la poliacrilamidase realiza en presencia de gelatina soluble. De esta manera el gel resultante dela polimerización contiene gelatina (colágeno desnaturalizado).Luego de realizar la corrida electroforética de las muestras el gel se lava en una solución con Tritón X100 y se incuba en un buffer apropiado quefavorece la actividad de las proteasas. El resultado de este tipo de geles, esque en la zona donde se ubicó una proteasa la gelatina habrá sido degradada.Esta degradación se revela tiñiendo el gel con colorantes que tengan afinidadpor proteinas, observándose una zona blanca donde hubo degradación.El grupo nro. 3 realizará una zimografía en gel copolimerizado congelatina para determinar actividad de metaloproteasas. El grupo nro. 4 realizaráuna zimografía en gel polimerizado con caseína en presencia de plasminógenopara determinar actividad de Activadores del plásminógeno.

• Extracción en gel.